花生根瘤菌

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實驗內容:

1.稱量>溶化→調pH >)過濾>分裝>加塞>包扎>滅菌>無菌檢查

2.干熱滅菌:裝入待滅菌物品升溫>恒溫>降溫>開箱取物

3.高壓蒸汽滅菌加水>裝物品>加蓋>加熱>排冷空氣+加壓>恒壓>降壓回零》排汽>取物. >無菌檢查

4.過濾除菌:組裝滅菌>連接→壓濾>無菌檢查>清洗滅菌

低溫存法:

公司產品僅用于科研

①簡單保存法,將瓊脂斜面孢子培養物、菌絲懸浮液以及由麩皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培養物置于4℃冰箱保存,保存時間不超過1 ~2個月，若將谷物原料制備的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蠟,以隔絕外界空氣和水汽,保持時間可達3~ 4個月;②液氮超di溫保存法,將生長穩定期懸浮在10%甘油或其他低冰點液體中,密封于安瓿管內，然后控制冷卻速度,使安瓿管溫度逐步下降至-35℃時， 即可置于-150 ~-196℃的液氮罐中保存。大多數微生物如病毒、噬菌體、多種細菌、放線菌、酵母和原蟲、特別是一些用冷凍干燥法有困難的微生物,都可用此法長期保存。

微生物菌種的培養:

花生根瘤菌

1孢子制備

(1)放線菌孢子的制備

一般采用瓊脂斜面培養基,培養基中含有一些適合產孢子的營養成分,如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。碳源和氮源不要太豐富（碳源約為1%,氮源不超過0.5%),碳源豐富容易造成生理酸性的營養環境,不利于放線菌孢子的形成，氮源豐富則有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下， 干燥和限制營養可直接或間接誘導孢子形成。放線菌斜面的培

養溫度大多數為28℃,少數為37 ℃,培養時間為5~ 14天。

(2)霉菌孢子的制備

霉菌的孢子培養,一般以大米、 小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養基。這是由于這些農產品中的營養成分較適合霉菌的孢子繁殖，而且這類培養基的表面積較大，可獲得大量的孢子。霉菌的培養-般為25~ 28 ℃,培養時間為4~ 14天。

2種子制備

(1)搖瓶種子制備

搖瓶種子進罐,常采用母瓶、子瓶兩級培養,有時母瓶種子也可以直接進罐。種子培養基要求比較豐富,并易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養成分不宜過濃,子瓶培養基濃度比母瓶略高,更接近種子罐的培養基配方。

(2)種子罐種子制備

種子罐種子制備的工藝過程,因菌種不同而異，一般可分為一級種子、 二級種子和三級種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中,經培養后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級種子， 把一級種子轉入發酵罐內發酵，稱為二級發酵。如果將一級種子接入體積較大的種子罐內,經過培養形成更多的菌絲,這樣制備的種子稱為二級種子，將二級種子轉入發酵罐內發酵稱為三級發酵。同樣道理,使用三級種子的發酵,稱為四級發酵。

脫水存法:

①沙土保存法,能產孢子的細菌、放線菌及霉菌可采用此法保存，即將沙和土以3:2比例混合經稀酸處理洗凈過篩,裝入小試管內裝置高度為1cm滅菌2~ 3次,烘干后即可將在斜面培養基上生長良好的孢子,用無菌蒸餾水2~ 2.5m制成孢子懸液，吸取少許加入沙土管中,經真空抽干,外觀呈松散狀態,于4℃冰箱保存,保存期可達5 ~7年。

②冷凍干燥法,將孢子懸浮液與保護劑相混合, 放在安瓿管內于-20 -30℃的乙醇浴中速凍。然后,在低溫下用真空泵抽干,用干冰使水汽結凍,熔封安瓿管,于低溫下保存。保存期可達5~ 10年之久。

③石蠟油封存法,在斜面菌種培養物上,倒上滅菌后的石蠟油,高出斜面1cm,于4℃冰箱或低溫干燥處保存，此法不適用于能利用石蠟油作碳源的微生物，保存期為一年以上。

菌種的具體保存方法

   微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。

低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。

菌種保藏方法大致可分為以下幾種：

1．傳代培養保藏法又有斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等（后者作保藏厭氧細菌用），培養后于4—6℃冰箱內保存。

2．覆蓋保藏法是傳代培養的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養物和穿刺培養物上面覆蓋滅菌，一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。

   載體保藏法是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。

   寄主保藏法用于目前尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。

5．冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現象除去水分（真空干燥）。

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